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 Projektbeschreibung/
Kurzfassung
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Phenolische Substanzen und antioxidatives Potential in Kakao- Gehalte und prozessierungsbedingte Veränderungen
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Auftraggeberin: Stiftung der Deutschen Kakao- und Schokoladenwirtschaft
Auftragnehmerin: Institut für Angewandte Botanik, Universität Hamburg
Projektbearbeiterin: Dipl.-Biol. Silke Elwers, wissenschaftliche Mitarbeiterin
Zusammenfassung
Je nach Herkunft, Genotyp und Standort werden signifikante qualitative Unterschiede frischer Kakaosamen gefunden. Zusätzlich wird die Qualität durch die spezifischen Fermentations- und Trocknungsbedingungen während der Verarbeitung zu Rohkakao beeinflusst. Das Flavour und die Farbe der Kakaobohnen sind zwei entscheidende Qualitätsparameter von Rohkakao, die besonders bei der Produktion von Edelschokoladen von Bedeutung sind. Beide Eigenschaften werden entscheidend durch die Zusammensetzung und den Gehalt der phenolischen Inhaltsstoffe des Kakaos geprägt.
Aufgrund ihres antioxidativen Potentials wird Polyphenolen eine gesundheitsfördernde Wirkung zugeschrieben. Die antioxidative Aktivität der phenolischen Komponenten hat eine präventivmedizinische Wirkung, welche Herzkrankheiten, Krebsentstehung und Arteriosklerose verzögern sowie entzündlichen Prozessen im menschlichen Körper vorbeugen kann. Diese gesundheitsfördernden Effekte von Kakao-Polyphenolen haben sich in letzter Zeit zu einem Feld hohen öffentlichen Interesses entwickelt und wurden bereits in verschiedenen wissenschaftlichen Veröffentlichungen thematisiert. Die meisten dieser Studien befassen sich jedoch nur mit Catechinen und deren Derivaten als die mengenmäßig wichtigste, jedoch nicht die einzige Gruppe der Kakao-Polyphenole. Zudem wurde bisher in keiner Studie ein Schwerpunkt auf die genetische und/ oder geographische Herkunft der untersuchten Kakaoproben gelegt.
Ziel des Projektes „Phenolische Substanzen und antioxidatives Potential in Kakao- Gehalte und prozessierungsbedingte Veränderungen“ war es, die bisher noch wenig untersuchte Abhängigkeit der phenolischen Inhaltsstoffe des Kakaos von genetischen und herkunftsspezifischen Faktoren zu analysieren. Anders als bei den meisten zuvor durchgeführten Studien wurde das gesamte Spektrum der in Kakao vorkommenden Polyphenole erfasst und mit seiner antioxidativen Wirkung korreliert. Dabei wurden auch die Auswirkung des Reifegrades sowie der Fermentation und Trocknung auf den Polyphenolgehalt berücksichtigt.
Innerhalb des Projektes wurden die Früchte von fünfzehn verschiedenen Klonen analysiert. Die Proben wurden von den Genbanken von vier verschiedenen tropischen Regionen geliefert: Ecuador, Ghana, Malaysia (Borneo) und Trinidad. Weitere Proben stammten aus den Gewächshauskulturen der Universität von Reading/ Großbritannien.
Die Auswahl der Klone wurde hauptsächlich anhand der Datenbank ICGD (International Cocoa Germplasm Database) der Universität Reading, UK getroffen. Charakteristika, die Rückschlüsse auf den Gehalt und die Zusammensetzung der phenolischen Komponenten zulassen, wie Flavour-Potential, Samenfarbe und Krankheitsresistenz dienten als Auswahlkriterien. Von sieben der analysierten Klone lagen Proben aus mindestens zwei verschiedenen Herkünften vor.
Die meisten der gesammelten Kakaofrüchte entwickelten sich nach freier Bestäubung. Für die Proben aus Ghana und Ecuador wurden Handbestäubungen durchgeführt, weshalb diese Früchte auch paternal definiert waren.
Verschiedene Fruchtreifestadien und eine klonspezifische Probe fermentierter Samen wurden aus Ecuador geliefert. Einige der frischen Samenproben aus Trinidad wurden vor der Analyse bei verschiedenen Temperaturen (30 °C und 60 °C) in einem Ofen getrocknet.
Die phenolischen Inhaltsstoffe wurden qualitativ und quantitativ analysiert. Daneben wurde ihr antioxidatives Potential ermittelt.
Für die qualitative und quantitative Analyse der phenolischen Komponenten wurden Roh-Polyphenolextrakte hergestellt, indem je 0,5 g einer gefriergetrockneten, gemahlenen und entfetteten Probe einmal mit 80 % und zweimal mit 60 % wässrigem Aceton extrahiert wurde. Nach dem Abdampfen des Acetons wurde der Rückstand in 100 ml 2 %iger Essigsäure gelöst.
Zur Messung des Gesamtpolyphenolgehalts der entfetteten Kakaoprobe wurde der Roh-Polyphenolextrakt mit Hilfe des Folin-Ciocalteu Verfahrens untersucht, wobei (-)-Epicatechin als Referenzsubstanz diente.
Die qualitative Analyse der phenolischen Komponenten erfolgte mit einem RP-HPLC-PDA Verfahren, wobei eine C18 -Säule und ein Gradient aus 2 % Esssigsäure und Acetonitril eingesetzt wurden.
Die antioxidative Kapazität der Kakaoproben wurde mit dem TEAC-Verfahren bestimmt, mit Hilfe dessen die so genannte Trolox ® Equivalent Antioxidative Capacity gemessen wird. Die Messergebnisse wurden durch die Essigsäure, welche in dem für alle anderen Untersuchungen hergestellten Roh-Polyphenolextrakt (s. o.) enthalten war, negativ beeinflusst. Daher wurde der TEAC-Test mit einem zentrifugierten Extrakt aus 10 mg Probe in 2 ml einer Lösung aus Aceton, Methanol und Phosphatpuffer (5 mM, pH 7,4) 6:2:2 (v/v/v) durchgeführt.
Als dominierende phenolische Komponenten wurden Epicatechin, Catechin, Cyanidin-3-ß-D-Galactosid, Cyanidin-3-a-L-Arabinosid und Protocatechusäure gefunden. Daneben enthielten die meisten Proben sieben Substanzen A-G, welche nicht abschließend charakterisiert wurden. Mit Hilfe der Spektralanalyse und einer weiterführenden Untersuchung mit einem HPLC-MS-Verfahren wurde Peak A eindeutig als ein Kaffeesäure-Ester spezifiziert. Bei den Peaks B-G handelt es sich um Procyanidine. Bei weiterführenden Untersuchungen einiger Proben wurden Spuren von Quercetin gefunden.
Von allen quantifizierten Polyphenolen wurde Epicatechin als die mengenmäßig dominierende Substanz in allen Kakaoproben identifiziert. Der Epicatechin-Anteil erreichte bis zu 48 mg/ g entfetteter Trockenmasse.
In der Literatur werden noch etliche weitere phenolische Substanzen beschrieben, die in den letzten Jahrzehnten in Kakaoproben nachgewiesen wurden. Trotz des Einsatzes der jeweiligen Referenzsubstanzen in einem Verfahren mit ausreichend niedrigen Nachweisgrenzen wurden diese Substanzen innerhalb des Projektes nicht nachgewiesen. Möglicherweise sind einige dieser phenolischen Substanzen in anderen Kakaoproben enthalten, aber sie könnten bei früheren Studien auch durch mikrobielle Aktivität und durch Abbauprozesse während der Extraktion gebildet worden sein. Auch in Extrakten frischer Samenschalen, Pulpa oder Fruchtschalen wurden die jeweiligen phenolischen Inhaltsstoffe nicht detektiert.
In den getrockneten und entfetteten Kakaoproben wurde ein Gesamt-Polyphenolgehalt von bis zu 19 % gefunden. Das antioxidative Potential ist mit dem Gesamt-Polyphenolgehalt gut korreliert. Dies lässt sich darauf zurückführen, dass alle relevanten phenolischen Inhaltsstoffe, die im Kakao gefunden wurden, ortho-Diphenolgruppen besitzen und daher gute Redoxkomponenten sind.
Die Ergebnisse unserer Studie zeigen, dass sowohl der Anteil als auch die Qualität der phenolischen Komponenten durch genetischen Faktoren beeinflusst werden. Der genetische Einfluss auf die Qualität der Polyphenole wird besonders deutlich im Falle der Varietät "CATONGO", der durch das Fehlen von Anthocyanen in großen Anteilen der Samen gekennzeichnet ist.
Das jeweilige Anbaugebiet mit seinen spezifischen agroökologischen Eigenschaften scheint die Zusammensetzung und vor allen Dingen den Gesamtgehalt an phenolischen Inhaltsstoffen mindestens genau so stark zu prägen wie das genetische Potential der untersuchten Samen. Dies gilt besonders für den Gehalt an Epicatechin. Auch der Gehalt an Protocatechusäure ändert sich mit den exogenen Faktoren. Er scheint einen Indikator für Stress darzustellen, wie etwa den Befall durch Pod Borer.
Das Trocknen unfermentierter Kakaosamen verringert den Gehalt der extrahierbaren Polyphenole beachtlich. Diese Verringerung ist bei 60 °C stärker als bei 30 °C. Dies lässt sich mit der stärkeren Zerstörung des Keimblattgewebes bei 60 °C erklären. Unter diesen Bedingungen kommt es zu einer Vermischung der Polyphenole mit den oxidierenden Enzymen, welche auch bei diesen Temperaturen zunächst noch aktiv sind.
Die fermentierte Probe aus Ecuador enthielt einen niedrigeren Anteil phenolischer Inhaltsstoffe als alle frischen Samenproben desselben Klons. Zusätzlich enthielt die fermentierte Probe Protocatechusäure, welche in den frischen Proben nicht gefunden wurde. Dieser Befund weist darauf hin, dass die Protocatechusäure durch den Abbau von Catechinen während der Fermentation und/ oder der Trocknung entstanden ist.
Die Untersuchung verschiedener Reifestadien zeigte eine starke Zunahme der phenolischen Komponenten in den sich entwickelnden Keimblättern von dem Zustand hundert Tage nach der Pollinierung bis zur Reife. Danach nimmt der Polyphenolgehalt der Kakaosamen allmählich wieder ab.
Die Ergebnisse unserer Studie zeigen, dass der prozentuale Anteil und die Qualität der Kakao-Polyphenole nicht nur vom Reifegrad und der Prozessierung abhängt, sondern auch von der Varietät und der Herkunft des Kakaos. Diese Beobachtungen sollten bei der Auswahl eines geeeigneten Rohmaterials für Schokoladenprodukte mit hoher antioxidativer Aktivität berücksichtigt werden.
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